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基因分型技術(shù)新突破：Allegro靶向基因分型技術(shù)詳解

基因分型（Genotyping）是利用分子生物學(xué)方法檢測(cè)生物個(gè)體基因型的技術(shù)，在醫(yī)學(xué)和農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值：在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域，常用于進(jìn)行形狀基因的精細(xì)定位、分子輔助育種、種質(zhì)資源鑒定等等；醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常用于分析診斷疾病導(dǎo)致的遺傳變異，分子遺傳機(jī)制、易感性位點(diǎn)篩選及藥物敏感位點(diǎn)篩選等。

目前常用的基因分型手段主要是基于NGS的簡(jiǎn)化基因組方法，包括GBS、RAD、ddRAD等，這些簡(jiǎn)化基因組方法都能夠提供開(kāi)放、無(wú)偏差的基因分型，但卻沒(méi)有一種技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)針對(duì)靶向基因區(qū)的高效分型——單基因、基因家族、啟動(dòng)子和增強(qiáng)子、基因簇及非編碼基因等都可能含有重要的與表型變異密切相關(guān)的多態(tài)性。因?yàn)閭鹘y(tǒng)的簡(jiǎn)化基因組技術(shù)，由于其以隨機(jī)的方式研究遺傳變異，獲取的信息大部分在這些區(qū)域之外，就導(dǎo)致了有價(jià)值標(biāo)記的檢測(cè)缺失。雖然經(jīng)典的微陣列的方法可以規(guī)避這一缺漏，但卻存在著當(dāng)基因池改變時(shí)會(huì)出現(xiàn)較強(qiáng)的檢測(cè)偏差和較差的可重復(fù)性問(wèn)題。

讓我們來(lái)了解一種兩全其美的新方法：

Allegro靶向基因分型，提供了一種快速、可擴(kuò)展、高效經(jīng)濟(jì)的單引物富集技術(shù)（SPET），基于新一代測(cè)序技術(shù)對(duì)各類(lèi)生物樣本的特異性靶向區(qū)域SNP進(jìn)行有針對(duì)性的測(cè)序分型。該方法可以通過(guò)捕獲每個(gè)靶向測(cè)序序列的SNP特異性數(shù)據(jù)點(diǎn)，提供豐富有效的測(cè)序數(shù)據(jù)，不僅有效獲得靶向區(qū)分型結(jié)果，更可以快速構(gòu)建具有可擴(kuò)展性及低成本單SNP位點(diǎn)檢測(cè)流程。

技術(shù)流程如下：

1. 將基因組酶切打斷，該步驟操作便捷，可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化；

2. 將片段化的基因組接上indexed adaptor ，DimerFree技術(shù)可消除接頭二聚體的形成;

3. 針對(duì)靶向區(qū)域設(shè)計(jì)的探針捕獲目標(biāo)區(qū)域捕獲；

4. 擴(kuò)增后獲得靶向區(qū)域序列文庫(kù)，測(cè)序后得到分型結(jié)果。

Allegro靶向基因分型通過(guò)探針設(shè)計(jì)及“雞尾酒”式的酶切組合進(jìn)行基因組片段化，能夠有效地將SNP控制在測(cè)序讀長(zhǎng)范圍內(nèi)，輔以?xún)?yōu)化過(guò)的探針設(shè)計(jì)，確保SNP可通過(guò)單端測(cè)序測(cè)序模式檢出。退火位點(diǎn)的設(shè)計(jì)也規(guī)避了已知多態(tài)性位點(diǎn)的位置，以確保擴(kuò)增過(guò)程不會(huì)因此而造成偏倚。如果選擇雙端測(cè)序測(cè)序，還可在read 2中獲得新的未知多態(tài)性位點(diǎn)信息，充實(shí)研究結(jié)果（下圖）。

Allegro靶向基因分型的優(yōu)勢(shì)如下：

• 方便在自動(dòng)化工作站上建庫(kù)
• 設(shè)計(jì)靈活
• 可擴(kuò)展復(fù)用
• 檢測(cè)準(zhǔn)確
• 集成了酶促打斷
• 低起始量（10 – 1100 ng）
• 高檢測(cè)通量（100 – >100,000 SNPs）
• 建庫(kù)周期短（<24 h）

截至目前，已有包括人，動(dòng)物，植物在內(nèi)的多個(gè)物種開(kāi)展了基于SPET技術(shù)的基因分型。

今天跟大家分享的是該技術(shù)在黑楊及玉米的研究中的應(yīng)用實(shí)例：

為了評(píng)估SPET技術(shù)的分型效果及技術(shù)性能，研究對(duì)10個(gè)玉米株系（5個(gè)近交系 F7, H99, HP301, Mo17, W153R; 5個(gè)雜交F1：A632XB73, B73XF7, W153RXHP301, B73XB96, B73XMo17）同時(shí)開(kāi)展了基于illumina MaizeSNP50芯片分型的研究和SPET分型，并對(duì)540株黑楊構(gòu)成的自然群體進(jìn)行SPET分型及Panel分型研究，以獲得與生物量表型相關(guān)的位點(diǎn)信息。

玉米研究中發(fā)現(xiàn)，全部樣本中目標(biāo)位點(diǎn)的覆蓋度十分相似（約50×，下圖A），通過(guò)提高覆蓋度閾值，檢測(cè)的準(zhǔn)確性有改善，在50×到達(dá)的平臺(tái)期后，準(zhǔn)確率可達(dá)97.2%（下圖B）。分析結(jié)果比較顯示，無(wú)論在準(zhǔn)確度和可重復(fù)性方面，自交系個(gè)體都比雜交系個(gè)體呈現(xiàn)更好的結(jié)果（下圖C、D）

針對(duì)黑楊的大規(guī)?；蚍中脱芯恐?，采用SPET技術(shù)，靶向?qū)崿F(xiàn)了目標(biāo)區(qū)域的捕獲分型，共捕獲靶向位點(diǎn)數(shù)66922個(gè)，并且在非靶向區(qū)域內(nèi)獲得了453170個(gè)非靶向多態(tài)性位點(diǎn)。等位基因頻率研究發(fā)現(xiàn)，目標(biāo)區(qū)域位點(diǎn)等位基因頻率在一定程度上與應(yīng)用的選擇標(biāo)準(zhǔn)有關(guān)（下圖），de novo方法側(cè)重*或極低的等位基因頻率。

對(duì)不同方法獲得的SNP分型結(jié)果進(jìn)行樣本間聚類(lèi)，發(fā)現(xiàn)de novo方法可增強(qiáng)樣本群體間聚類(lèi)的性能，更好的體現(xiàn)出差異性類(lèi)群。（下圖）

綜上，Allegro靶向基因分型的SPET技術(shù)一次性突破了舊基因分型技術(shù)的瓶頸，將靶向捕獲研究與可拓展性的簡(jiǎn)化基因組相結(jié)合，是一種可靠高效低成本的基因分型技術(shù)流程。在實(shí)現(xiàn)了可拓展研究的同時(shí)，縮減了實(shí)驗(yàn)耗時(shí)。這些優(yōu)勢(shì)彌補(bǔ)了此前微陣列技術(shù)和簡(jiǎn)化基因組技術(shù)的不足，為大規(guī)模群體的穩(wěn)定靶向基因分型提供了具有高性?xún)r(jià)比的技術(shù)手段。

主要參考文獻(xiàn)：

Single primer enrichment technology as a tool for massive genotyping: a benchmark on black poplar and maize. ANNALS OF BOTANT, 2019.