加熱塊均勻性分析

作者：文/ Andrew Birnie 本文作者供職于PCRmax公司。 文章來源：PROCESS制藥網(wǎng) 《制藥業(yè)》 發(fā)布時(shí)間：2015-12-10

圖 1 qPCR空心銀塊示意圖 (Eco 48 PCRmax)。該創(chuàng)新硬件具有穩(wěn)健的熱性能，能夠加速 qPCR 操作規(guī)程

新一代測(cè)序技術(shù)(NGS)憑借的數(shù)據(jù)吞吐率、可擴(kuò)展性和速度使得研究人員能夠以的水平研究生物系統(tǒng)。現(xiàn)如今，基因組研究問題越來越復(fù)雜，除了傳統(tǒng)的DNA測(cè)序技術(shù)外，迫切需要更深入的信息支持。新一代測(cè)序技術(shù)地彌補(bǔ)了這一空缺，成為解決轉(zhuǎn)譯研究領(lǐng)域諸多問題的日常研究工具，例如臨床診斷、農(nóng)業(yè)基因組以及法醫(yī)學(xué)。

但是這同時(shí)也是挑戰(zhàn)。NGS 運(yùn)行每失敗一次都將給實(shí)驗(yàn)室?guī)砭薮蟮膿p失，事實(shí)上有時(shí)候造成的損失可以高達(dá)3000美元。

為了確保測(cè)序技術(shù)的成本效益并精簡(jiǎn)流程提高準(zhǔn)確性，實(shí)驗(yàn)室需要確保不會(huì)讓缺乏性和均勻性的qPCR技術(shù)對(duì)運(yùn)行造成破壞。這可能與所使用的儀器有很大關(guān)系。每一PCR系統(tǒng)中的多種因素，從溫度控制到光滲透，都會(huì)對(duì)每次運(yùn)行的可靠性產(chǎn)生影響。通過實(shí)現(xiàn)*均勻性，制造商能夠確保每次運(yùn)行*可靠且準(zhǔn)確。

為了確?？煽啃院蜏?zhǔn)確性，商用儀器中也逐步采用創(chuàng)新型新技術(shù)。本文將介紹這些儀器(例如Eco 48實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)，PCRmax)如何在加熱塊中實(shí)現(xiàn)*的均勻性，以及其可靠性等級(jí)在工作實(shí)驗(yàn)室范圍內(nèi)產(chǎn)生的影響。

圖 2顯示所有 48 個(gè)孔板數(shù)據(jù)的基線校正擴(kuò)增圖。數(shù)據(jù)分析顯示平均 Cq 為 13.31，標(biāo)準(zhǔn)偏差為 ±0.061，而整個(gè)孔板的 %CV 僅為 0.46%，表示精度非常高

提高NGS技術(shù)性能

的DNA擴(kuò)增是基因組研究的基本追求。同時(shí)，高吞吐率 NGS技術(shù)的研發(fā)也通常被視為過去30年生物科學(xué)領(lǐng)域革命性的創(chuàng)新之一。如今這一強(qiáng)度的技術(shù)已經(jīng)取代了以桑格測(cè)序?yàn)樾袠I(yè)標(biāo)準(zhǔn)的傳統(tǒng)PCR技術(shù)，例如毛細(xì)管和凝膠技術(shù)。

NGS技術(shù)能夠使研究人員同時(shí)處理百萬條多量級(jí)的平行 DNA 序列，速度比傳統(tǒng)測(cè)序技術(shù)更快。但是NGS的成本依然很高;一套商用NGS系統(tǒng)的價(jià)格大約在15萬~100萬美元之間，同時(shí)驅(qū)動(dòng)這些流程的成本也非常高。因此，方法研制的關(guān)鍵便在于優(yōu)化每次運(yùn)行的條件，將故障風(fēng)險(xiǎn)降至zui低，實(shí)現(xiàn)zui大化。目標(biāo)庫定量已被視為能夠利用成本有效性技術(shù)從而簡(jiǎn)化NGS工作流的領(lǐng)域。

NGS流程需要制備目標(biāo)庫，并且在該庫中靶分子片段將與銜接子相融合，隨后通過聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序。zui終庫中目的DNA片段的大小將成為構(gòu)建NGS庫的關(guān)鍵參數(shù)。如果 NGS平臺(tái)上加載的模板過少，運(yùn)行的效率將非常低。如果平臺(tái)上加載的模板過多，那么不僅會(huì)導(dǎo)致效率低下，還會(huì)增加*失效的可能性。因此穩(wěn)健且可靠的庫定量非常關(guān)鍵。

圖 3顯示孔板中 48 個(gè)孔數(shù)據(jù)的標(biāo)稱熔點(diǎn)曲線。100bp PCR 產(chǎn)物在 75~95?℃ 范圍內(nèi)熔化，Eco 48以0.1?℃的溫度變化測(cè)量熒光性，IV 級(jí) SNP 的檢測(cè)精度需要超過 99%

定量PCR(qPCR)是NGS庫定量可選的技術(shù)之一。但是，并不是所有的PCR系統(tǒng)均能夠帶來足夠的熱均勻性，滿足NGS系統(tǒng)安全加載所需的高重復(fù)性和度。此外，冗長(zhǎng)的qPCR操作規(guī)程會(huì)嚴(yán)重影響整個(gè)NGS運(yùn)行的效率。由于一次失敗運(yùn)行所損失的成本超過了高性能qPCR儀器的價(jià)格，因此采用穩(wěn)健的定量qPCR技術(shù)被視為實(shí)現(xiàn)一致NGS的zui簡(jiǎn)單且成本效益的方式之一。

圖 4(A和 B)：孔板48個(gè)孔的Cq和Tm數(shù)據(jù)概覽。所有48個(gè)樣本的記錄zui大變化為0.24個(gè)周期，整個(gè)孔板的Tmzui大范圍為 0.2?℃(84.3~84.5?℃)

選擇正確的 PCR 技術(shù)

qPCR可以監(jiān)控退火流程期間熒光引物的排放物，從而可以監(jiān)控鏈擴(kuò)增。為了在適當(dāng)?shù)姆磻?yīng)階段進(jìn)行定量分析，將實(shí)時(shí)捕獲熒光信號(hào)。這可以克服傳統(tǒng)、半定量端點(diǎn)檢測(cè)產(chǎn)生的相關(guān)不性，包括樣本之間PCR效率的不明變化以及回推起始量時(shí)產(chǎn)生的誤差。

溫度控制是qPCR技術(shù)的核心所在;其將決定引物能否有效結(jié)合以及聚合酶能否起到*效果。為了實(shí)現(xiàn)高準(zhǔn)確度，實(shí)時(shí) PCR熱系統(tǒng)必須確保整個(gè)加熱快的溫度均勻性，確保能夠以相同速率的反應(yīng)處理所有的樣本。但是，標(biāo)準(zhǔn)qPCR系統(tǒng)在50~60?℃溫度范圍內(nèi)的熱準(zhǔn)確性只有大約 ±0.5?℃。通常這不足以地定義聚類密度，并且如果qPCR平臺(tái)低于或超過實(shí)際庫濃度時(shí)，NGS 運(yùn)行可能會(huì)面臨故障風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于 qPCR實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格的MIQE(定量實(shí)時(shí)PCR試驗(yàn)發(fā)布的zui低限度的信息)指南強(qiáng)調(diào)了精度的重要性，需要采用靈敏度更高的qPCR技術(shù)。

傳統(tǒng)qPCR系統(tǒng)采用珀耳帖熱保溫塊來驅(qū)動(dòng)熱循環(huán)。加熱這些實(shí)心塊的整個(gè)表面數(shù)據(jù)能量密集型流程。在平衡至穩(wěn)定時(shí)期之前，大多數(shù)基于珀?duì)栙N的系統(tǒng)會(huì)超過所需的反應(yīng)溫度。加熱塊范圍內(nèi)所有孔達(dá)到該點(diǎn)所需的時(shí)間將延長(zhǎng)運(yùn)行時(shí)間。更重要的是，這種加熱方法會(huì)導(dǎo)致較高的熱不均勻性(TNU)，數(shù)值為±0.5?℃，并導(dǎo)致較差的升溫斜率。不準(zhǔn)確和效率低導(dǎo)致傳統(tǒng)的實(shí)心塊qPCR 無法適用于高性能應(yīng)用。

qPCR加熱技術(shù)的發(fā)展克服了上述難題?，F(xiàn)代系統(tǒng)利用*均勻的空心銀塊，其中將流經(jīng)導(dǎo)電流體。使用單一的珀?duì)栙N設(shè)備來加熱和冷卻流體，隨后流體通過反向攪拌器將在所有的樣本孔中均勻循環(huán)。這可以確保穩(wěn)健的熱性能，使得95?℃條件下的 TNU值低于±0.1?℃，從而可以縮短運(yùn)行時(shí)間。使用該系統(tǒng)的標(biāo) 40循環(huán)PCR操作規(guī)程大約需要40?min的時(shí)間才能完成，而優(yōu)化后的流程只需要15 min的時(shí)間便可完成。

熒光監(jiān)測(cè)技術(shù)取得的發(fā)展改善了qPCR技術(shù)的性能。高性能光學(xué)系統(tǒng)使得能夠在一次反應(yīng)中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)多達(dá)四種目標(biāo)物，并且先進(jìn)的探測(cè)器陣列能夠監(jiān)控源自所有孔的熒光，允許系統(tǒng)記錄每個(gè)孔、過濾器和周期，不會(huì)遺漏任一數(shù)據(jù)點(diǎn)。zui終，利用穩(wěn)定的發(fā)光二極管(LED)幫助生成準(zhǔn)確的數(shù)據(jù)，可以延長(zhǎng)儀器使用壽命，降低折舊成本。

下列案例研究說明了加熱塊熱均勻性的改善是如何帶來高性能NGS應(yīng)用所需的靈敏度、精度和整體效率。

案例研究：提高 qPCR 精度

48個(gè)復(fù)制樣本通過PCRmax Eco48進(jìn)行高分辨率熔解(HRM) 操作。HRM 確保能夠?qū)z傳變異進(jìn)行準(zhǔn)確地分析，例如量化單核苷酸多態(tài)性(SNP)，就精度而言是需熱量zui大的操作規(guī)程之一。

48個(gè)樣本孔中的每一個(gè)都注滿了 1×10 8個(gè)起始模板的副本，zui終體積為10?ul?？装暹M(jìn)行了密封，并在12?000 rpm 條件下進(jìn)行離心分離1?min，未優(yōu)化40循環(huán) PCR 操作規(guī)程的總體完成時(shí)間為 43min。使用源自 Promega 的 GoTaq® QPCR GoTaq® QPCR Master Mix (2x)(產(chǎn)品代碼 A6001)對(duì)模板進(jìn)行擴(kuò)增處理，用于40次循環(huán)。在60?℃操作結(jié)束時(shí)將收集熒光光譜數(shù)據(jù)。使用生態(tài)研究軟件分析結(jié)果，以確定定量循環(huán) (Cq)、熒光檢測(cè)點(diǎn)以及48個(gè)復(fù)制品中每一個(gè)的解鏈溫度 (Tm) 值。

圖 2 顯示了所有 48 個(gè)孔的基線校正擴(kuò)增圖譜。該圖清晰展示了整個(gè)孔板的擴(kuò)增精度。數(shù)據(jù)分析顯示平均 Cq 為 13.31，標(biāo)準(zhǔn)偏差為 ±0.061。這意味著整個(gè)孔板的變異系數(shù) (%CV) 僅為 0.46%，表示精度非常高。 PCR產(chǎn)物擴(kuò)增后運(yùn)行熔化階段，借此來確定 Tm，而Tm是確定加熱塊均勻性zui有效的衡量標(biāo)準(zhǔn)之一。擴(kuò)增產(chǎn)物在75~95℃范圍內(nèi)熔化，Eco 48以0.1℃的溫度變化為變量來測(cè)量熒光性， IV級(jí) SNP的檢測(cè)精度需要超過 99%。圖 3 顯示了標(biāo)稱熔點(diǎn)曲線。所有 48個(gè)孔板的平均 Tm 為 84.45℃，標(biāo)準(zhǔn)偏差為 ±0.058，相當(dāng)于整個(gè)孔板的%CV 僅為0.07%。這說明加熱塊的溫度均勻性非常*。圖4A和4B概述了該實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。

推動(dòng)基因組學(xué)未來發(fā)展

采用熱準(zhǔn)確性的系統(tǒng)能夠提高所有PCR應(yīng)用的分析生產(chǎn)率。但是，人們?cè)絹碓秸J(rèn)為更大程度的溫度控制會(huì)給用戶在NGS 流程期間造成更大的成本，這就使得高性能qPCR成為例行測(cè)序的關(guān)鍵特點(diǎn)。采用創(chuàng)新加熱塊技術(shù)的qPCR儀器，例如PCRmax Eco 48，可以在40??min內(nèi)完成熱均勻性和快速循環(huán)，每次溫度變化后，整個(gè)加熱塊立即會(huì)發(fā)生±0.1℃ 的均勻性變化。